آزمایش شمارش رتیکولوسیت

رتیکولوسیت ها گلبولهای قرمز نابالغ حاوی باقیمانده های اسید ریبونوکلئیک ریبوزومی هستند که به تازگی از مغز استخوان آزاد شده اند . ویژگی ریبوزوم ها ، ایجاد واکنش با رنگهای قلیائی خاص مثل آزور B ، بریلیانت کرزیل بلو یا نیو متیلن بلو  (NMB) و تشکیل رسوبی  بصورت گرانول یا فیلامانت  آبی یا بنفش می باشد . این واکنش فقط با رنگهای حیاتی و در نمونه های فیکس نشده صورت می گیرد. به علت زنده بودن سلول ها هنگام رنگ آمیزی، به این نوع رنگ آمیزی، رنگ آمیزی حیاتی  اطلاق می گردد.

مراحل مختلف بلوغ رتیکولوسیت ها با توجه به مشخصات مرفولوژیکی،  قابل شناسایی می باشند.  نابالغ ترین رتیکولوسیت ها حاوی بیشترین مقدار مواد رسوبی ، و بالغ ترین آنها  فقط دارای چند جز یا رشته کوتاه از این مواد می باشند. بر این اساس ، رتیکولوسیت ها  به چهار گروه تقسیم می شوندکه گروه1  دارای کلامپ رتیکولوم و گروه 4 حاوی چند گرانول کوچک می باشند. گروه 2 و3 نیز از لحاظ مرفولوژی بین این دو گروه قرار می گیرند. چون اکثر رتیکولوسیت هایی که در خون محیطی دیده می شوند  از گروه4 هستند، شناسایی دقیق رتیکولوسیتها  اثر قابل توجهی بر روی صحت شمارش  این سلولها دارد . بنابراین گلبولی می بایست به عنوان رتیکولوسیت شمارش گردد که دارای هسته نبوده و داخل آن دو یا چند قطعه از رسوب آبی رنگ ، که همان RNA ریبوزومی است، دیده شود.      

رتیکولوسیتها در رنگ آمیزی معمولی( با رنگ های گروه  رومانوفسکی)، بدلیل ترکیب بازوفیلی سیتوپلاسم و اسیدوفیل هموگلوبین حالت بازوفیل منتشری پیدا کرده و به بصورت "پلی کروماتیک" مشاهده می گردند . این پدیده بطور معمول در رتیکولوسیتهای  نابالغ که دارای بیشترین میزان  RNA هستند،دیده می شود .

  

رنگ آمیزی

تهیه محلول رنگ:

رنگ توصیه شده در مراجع  معتبر بین المللی نیو متیلن بلو می باشد برای تهیه محلول رنگ، می بایست 1/0 گرم  رنگ نیومتیلن بلو  ((NMB   یا آزور B خالص را در 100 میلی لیتر بافر فسفات ایزو اسموتیک با 5 /6 PH =   حل نمود.  برای ساخت بافر ذکر شده از محلولهای زیر استفاده می شود :

A:      NaH₂PO₄ , 2H₂O                23.4g/L       (150mmol/L)

B:      Na₂HPO₄                          21.3 g/L      (150mmol/L)

در صورتیکه 51  میلی لیتر از محلول  A  با  35 میلی لیتر از محلول B مخلوط گردد ،  PH بافر حاصل ، 5/6  خواهد بود .

رنگ را میتوان در100 میلی لیتر سیترات سالین نیز حل کرد که برای تهیه سیترات سالین ، یک حجم سیترات سدیم 30 گرم در لیتر  با 4 حجم کلرید سدیم  9 گرم در لیتر مخلوط  می شود.

 محلول رنگ را می بایست درون شیشه ای قهوه ای رنگ ریخته و در مدت 24 ساعت  به دفعات تکان داد .این محلول در دمای

 6-2 درجه سانتیگراد قابل نگهداری می باشد . در این دما ، نیمه عمر رنگ حدود یک ماه است . هر بار قبل از استفاده،  باید حجم مورد نیاز از رنگ را به منظور خارج نمودن هر گونه ذره اضافی یا رسوب  ، با کاغذ صافی فیلتر نمود.

روش رنگ آمیزی:

برای رنگ آمیزی باید دو یا سه قطره رنگ NMB را با پیپت پاستور داخل لوله شیشه ای یا پلاستیکی به ابعاد 10×75  میلی متر ریخته و به همین حجم  ، خون حاوی ضد انعقاد EDTA به آن اضافه کرده و پس از مخلوط کردن به مدت 15 تا 20 دقیقه در دمای 37 درجه نگهداری نمود . قبل از تهیه گسترش می بایست  لوله را به آرامی تکان داد  تا گلبولهای قرمز  مجددا به حالت سوسپانسیون درآیند. گسترش ها پس از تهیه و خشک شدن،  بدون فیکساسیون و انجام رنگ آمیزی دیگری،توسط میکروسکوپ قابل بررسی می باشند .

حجم دقیق خونی که به محلول رنگ اضافه می شود بستگی به تعداد گلبولهای قرمز دارد . در موارد آنمی، مقدار خون بیشتر و در پلی سیتمی، مقدار خون کمتری ، نسبت به حالت طبیعی ، می بایست با رنگ مخلوط شود .

در یک گسترش مناسب ، ریبوزوم رتیکولوسیت ها به رنگ آبی در آمده و سلولهای بالغ در سطح لام به شکل سایه های کمرنگ آبی مایل به سبز دیده می شوند .

رنگ آمیزی و شمارش رتیکولوسیت خون در شرایطی که نمونه بعد از نمونه گیری در دمای 6-2 درجه نگهداری شود تا 24 ساعت امکانپذیر می باشد . با گذشت 8-6  ساعت از زمان نمونه گیری و ماندن خون در حرارت آزمایشگاه  ، رتیکولوسیت ها به تدریج بالغ شده و به گلبول قرمز بالغ تغییر می یابند که این امر بطور کاذب موجب کاهش درصد رتیکولوسیت ها  می گردد. بنابراین توصیه می شود شمارش رتیکولوسیت بلافاصله بعد از جمع آوری نمونه انجام شود.

نحوه شمارش و گزارش درصد رتیکولوسیت

برای شمارش و تعیین درصد رتیکولوسیت ، گسترش نباید خیلی نازک تهیه شده باشد و محلی از گسترش جهت شمارش انتخاب شود که سلولها به خوبی رنگ شده و روی هم نیز قرار نگرفته باشند . برای تعیین درصد رتیکولوسیت ها از عدسی شیئ روغنی و در صورت امکان از عدسی های چشمی دارای دیافراگم قابل تنظیم استفاده میشود. تعداد گلبولهای قرمزی که باید مورد ارزیابی قرارگیرند رابطه معکوس با تعداد رتیکولوسیت ها دارد. بنابراین به منظور افزایش دقت در شمارش ، هرچه تعداد رتیکولوسیت ها کمتر باشد می بایست تعداد گلبولهای قرمز بیشتری مورد بررسی قرارگیرند و بالعکس.

برای مثال اگر فرض کنیم به ازای دیدن 1000 گلبول قرمز 25 سلول رتیکلوسیت را شمارش

کنیم حال با استفاده از این اطلاعات درصد رتیک را محاسبه میکنیم که میشود 2.5% .

در این تست خون را با نسبت مساوی با رنگ حیاتی کریزل بلو مخلوط کرده و بعد از سپری شدن حدود 20 دقیقه در دمای 37 درجه از آن لام تهیه کرده و رتیکها را در بین 1000 RBC ( حدود 10 شان 100 تایی از اریتروسیتها) شمارش کرده و بر حسب در صد گزارش میکند

مقادیر مرجع

 در بزرگسالان سالم شمارش رتیکولوسیت 5/1-5/0 درصد و در نوزادان 6-2 درصد می باشد که تا انتهای هفته دوم زندگی ، به میزان بزرگسالان تنزل می یابد.